摘要
目的 探讨同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）与反复妊娠丢失（recurrent pregnancy loss，RPL）的 相 关 性 ，及 其 对 行 体 外 受 精/卵 胞 质 内 单 精 子 注 射 -胚 胎 移 植（in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer，IVF/ICSI-ET）治疗 RPL患者临床妊娠结局的影响。
方法 本研究为回顾性队列研究，选取 2020年 12月至 2024年 3月于郑州大学第三附属医院生殖健康医院就诊，行IVF/ICSI-ET患者的临床资料，根据妊娠丢失史分为对照组（既往从未发生妊娠丢失，n=1 027）及RPL组（n=743），比较两组患者外周血Hcy水平。采用多因素logistic回归矫正混杂因素的影响，分析 Hcy 是否是影响 RPL 的相关因素。将 RPL 患者根据 Hcy 四分位数分为 4 个亚组，分别为Q1 亚 组（Hcy<7.03 μmol/L）、Q2 亚 组（7.03 μmol/L≤Hcy<8.63 μmol/L）、Q3 亚 组（8.63 μmol/L≤Hcy<10.44 μmol/L）、Q4亚组（Hcy≥10.44 μmol/L），进一步分析不同Hcy水平对RPL患者行IVF/ICSI-ET后妊娠结局的影响。
展开剩余91%结果 ①对照组与RPL组患者基线情况：女方年龄、男方年龄、女方体质量指数（body mass index，BMI）、不孕年限、不孕因素、外周血 Hcy 水平，两组间差异均有统计学意义（均 P<0.05）。②多因素logistic回归模型矫正女方年龄、男方年龄、女方BMI、不孕年限、不孕因素后，结果显示，Hcy水平异常升高是 RPL的独立危险因素（aOR=1.366，95% CI：1.298~1.438，P<0.001）。③4个亚组 RPL患者基线情况：Q1亚组、Q2亚组、Q3亚组、Q4亚组患者的窦卵泡计数组间比较差异有统计学意义［17.00（11.00，24.00），15.00（10.00，24.00），14.00（7.00，22.25），15.50（8.00，22.00），P=0.043］，其余基线情况比较差异均无统计学意义（均 P>0.05）。④4个亚组 RPL患者妊娠结局比较：Q1亚组、Q2亚组、Q3亚组和 Q4亚组患者的流产率分别为 18.18%（18/99）、30.61%（30/98）、33.70%（31/92）、35.96%（32/89），活产率分别为44.26%（81/183）、36.17%（68/188）、32.80%（61/186）、30.65%（57/186），流产率和活产率组间比较差异均有统计学意义（P=0.033，P=0.036）。其中，Q3亚组流产率、Q4亚组流产率及活产率均显著高于Q1亚组，且差异均具有统计学意义（均q<0.05）。然而，4个亚组患者临床妊娠率及早期流产率差异均无统计学意义（均 P>0.05）。多因素 logistic回归校正混杂因素后，以Q1亚组为对照，其余各组与其相比，临床妊娠率差异均无统计学意义（均 P>0.05）。Q3亚组早期流产率（aOR=2.184，95% CI：1.077~4.426，P=0.030）、Q4亚组早期流产率（aOR=2.290，95% CI：1.116~4.697，P=0.024）均显著高于 Q1 亚组；Q3 亚组流产率（aOR=2.207，95% CI：1.125~4.330，P=0.021）、Q4 亚组流产率（aOR=2.377，95% CI：1.209~4.674，P=0.012）均显著高于 Q1亚组；Q3亚组活产率（aOR=0.615，95% CI：0.401~0.944，P=0.026）、Q4亚组活产率（aOR=0.560，95% CI：0.364~0.863，P=0.009）均显著低于 Q1亚组，差异均具有统计学意义。
结论 Hcy水平异常升高是 IVF/ICSI-ET 患者发生 RPL的高危因素，并可能对RPL患者IVF/ICSI-ET妊娠结局产生不利影响。
同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是一种含硫氨基酸，源于必需氨基酸甲硫氨酸转化为半胱氨酸的过程［1］。其可在多种组织内合成，经甲基化参与DNA的代谢，与多种疾病的发生发展有直接或间接关系［2］。反复妊娠丢失（recurrent pregnancy loss，RPL）的定义在流产孕周、流产次数、是否连续发生流产及是否包括生化妊娠等方面尚存争议［3］。结合欧洲人类生殖与胚胎学会（European Society of Human Reproduction and Embryology，ESHRE）指南，RPL是指2次或2次以上的连续或者非连续的流产，包含生化妊娠，其发生率尚不明确［4］。其可能的病因包括染色体或基因异常、解剖因素、内分泌因素、自身免疫因素、易栓症等［5］。
1969年，Hcy可导致动脉粥样硬化性疾病的假说首次被提出［6］，此后Hcy作为心脑血管疾病的危险因素已获专家共识［7］。此外，相关研究表明，血浆中Hcy水平每升高5 μmol/L，全因死亡率风险将增加33.6%［8］。近年来许多研究也发现了高水平同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinemia丰泰优配，HHcy）对生殖方面的负面影响，包括流产、胎儿死亡、妊娠期高血压疾病、妊娠糖尿病及男性精子活力低、精子浓度降低等［9-12］，同时其也与辅助生殖技术的成功率相关［13］。
然而Hcy与RPL之间的关系及其对RPL患者的妊娠结局仍尚无完全定论。因此，本研究通过回顾性分析行体外受精/卵胞质内单精子注射-胚胎移植（in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer，IVF/ICSI-ET）治疗患者的相关资料，旨在探讨Hcy与RPL的相关性，并观察其对RPL患者IVF/ICSI-ET妊娠结局的影响。
资料与方法一.研究对象本研究为回顾性队列研究。纳入2020年12月至2024年3月于郑州大学第三附属医院生殖健康医院就诊，行IVF/ICSI-ET治疗的不孕症患者临床资料。纳入标准：①女方年龄为20~45岁；②至少获得1枚可利用胚胎。排除标准：①夫妻任意一方染色体核型异常；②子宫解剖结构异常，如双角子宫、纵隔子宫等；③存在未经治疗的宫腔粘连、息肉或患有严重影响宫腔形态的子宫肌瘤、子宫腺肌病等；④内分泌异常，如甲状腺功能异常、糖尿病等；⑤免疫学疾病，如抗磷脂综合征、系统性红斑狼疮、干燥综合征等；⑥血栓前状态；⑦供卵、供精周期；⑧反复种植失败；⑨胚胎植入前遗传学检测周期；⑩重复周期；⑪重要数据记录不全周期。所有临床数据均通过医院电子病历系统统一提取，并由两名独立研究人员交叉核对，确保数据准确性。本研究所有流程符合1964年《赫尔辛基宣言》及其后来修正案或类似的伦理准则，通过了郑州大学第三附属医院伦理委员会审核（伦理号：2024-359-01），并豁免患者知情同意。
二.临床方案和分组1.Hcy检测：采用酶循环法试剂盒（美国贝克曼库尔特公司），检测仪器为AU5800全自动生化分析系统（美国贝克曼库尔特公司），分析灵敏度为10.0 μmol/L时吸光度变化率ΔA/min≥0.01，线性范围3~50 μmol/L。实验室严格质控包括：每10 d使用配套校准品校准仪器，试剂更换或维护后立即重校准；每天检测前运行低、中、高值质控品，确保批内/批间变异系数（coefficient of variation，CV）分别<5%和<8%。样本采集后2 h内离心，排除溶血、黄疸及脂血样本，-20 ℃保存并复融混匀后检测。本实验选取移植前约1周患者行Hcy检测的结果。
2.分组：根据既往妊娠丢失史将患者分为对照组（既往从未发生妊娠丢失）及RPL组。将RPL患者根据Hcy四分位数分为4个亚组，分别为Q1亚组（Hcy<7.03 μmol/L）、Q2亚组（7.03 μmol/L≤Hcy<8.63 μmol/L）、Q3亚组（8.63 μmol/L≤Hcy<10.44 μmol/L）、Q4亚组（Hcy≥10.44 μmol/L）。在本研究中，妊娠丢失次数为行Hcy检测之前的总次数。参考ESHRE指南，妊娠丢失定义为妊娠24周前的胎儿自然死亡，RPL定义参见文献［4］。
3.临床方案
（1）控制性卵巢刺激方案：根据本研究中患者的年龄、卵巢储备功能、基础性激素水平、体质量指数（body mass index，BMI）等为患者制定控制性超促排卵方案，主要包括早卵泡期长方案、黄体中期长方案、拮抗剂方案，促排卵用药方案依本中心常规进行，参见文献［14］。
（2）新鲜胚胎移植：根据男性患者的病史及精液质量，对获得的卵母细胞行常规IVF或ICSI操作。如果子宫内膜状况良好且无移植禁忌证，受精后第3天进行新鲜卵裂期胚胎移植或第5天进行囊胚移植。
（3）冻融胚胎移植（frozen-thawed embryo transfer，FET）周期内膜准备及黄体支持方案：新鲜周期未移植者择期行FET。根据患者病史和既往卵泡发育情况制定个体化的FET子宫内膜准备方案，主要包括自然周期、诱导排卵周期、人工周期及降调节+人工周期等。持续监测卵泡、子宫内膜情况及性激素水平，随后根据具体情况转化子宫内膜丰泰优配，采用本中心常规黄体支持［阴塞黄体酮阴道缓释凝胶（雪诺同，德国默克）90 mg，qd和口服地屈孕酮（达芙通，美国雅培）10 mg，tid］，内膜转化后第3天移植卵裂期胚胎或第5天移植囊胚。移植后14 d测血β-人绒毛膜促性腺激素（β-human chorionic gonadotrophin，β-hCG），若血β-hCG<1 U/L则停用黄体支持。移植后30 d行阴道超声检查。如妊娠，黄体酮阴道缓释凝胶于移植后45 d停药，达芙通于移植后65 d逐渐减量至停药［15］。
4.观察指标及其定义：主要观察指标是流产率（妊娠28周前自然流产周期数/临床妊娠周期数×100%）和活产率（妊娠满28周活产分娩周期数/总移植周期数×100%）。次要观察指标：临床妊娠率（临床妊娠周期数/总移植周期数×100%，超声显示一个或多个孕囊诊断为临床妊娠，包括宫内妊娠、异位妊娠、宫内外同时妊娠以及仅见孕囊而未见胎心）和早期流产率（妊娠12周内自然流产周期数/临床妊娠周期数×100%）。
三.统计学方法采用SPSS26.0软件进行统计学分析。计量资料不符合正态分布和（或）方差齐性，以中位数（第25百分位数，第75百分位数）［M（Q1，Q3）］表示，组间比较采用Kruskal-Wallias H秩和检验，检验水准α=0.05；计数资料以率或构成比（%）表示，组间比较采用χ2检验，理论频数<5时，组间比较采用Fisher精确概率法，检验水准α=0.05。计量资料与计数资料的组间两两比较采用Benjamini-Hochberg法进行错误发现率（false discovery rate，FDR）校正，显著性阈值定义为q<0.05，其中q值为FDR校正后的P值。通过多因素logistic回归分析RPL的相关因素。通过单因素及多因素logistic回归矫正RPL患者临床妊娠结局的相关混杂因素，P<0.05认为差异具有统计学意义。
结果一.所有患者临床特征比较本研究共纳入1 770例患者，其中对照组1 027例患者，RPL组743例患者。对照组与RPL组患者女方年龄、男方年龄、女方BMI、不孕年限、不孕因素和Hcy水平差异均有统计学意义（均P<0.05），详见表1。
二.影响RPL的单因素及多因素logistic回归分析将表1中各基线资料纳入到RPL的单因素logistic回归分析，其中Hcy水平、女方年龄、男方年龄、不孕年限、女方BMI、不孕因素单因素logistic回归结果P<0.10。以单因素logistic回归结果P<0.10的各指标为自变量采用输入法进行多因素回归分析，结果如表2所示，Hcy水平（aOR=1.366，95% CI：1.298~1.438，P<0.001）、女方年龄（aOR=1.041，95% CI：1.005~1.079，P=0.025）、男方年龄（aOR=1.046，95% CI：1.012~1.082，P=0.008）升高是RPL的危险因素。不孕年限（aOR=0.661，95% CI：0.624~0.700，P<0.001）增加是RPL的保护因素。
三.接受IVF/ICSI-ET的RPL患者的基线资料比较RPL亚组患者窦卵泡计数组间比较差异有统计学意义（P<0.05），其余指标差异均无统计学意义（均P>0.05），详见表3。
四.接受IVF/ICSI-ET的RPL患者妊娠结局的比较4个亚组患者中，流产率及活产率差异均具有统计学意义（均P<0.05），组间比较显示，Q3和Q4亚组流产率及活产率显著高于Q1亚组，且差异均具有统计学意义（均q<0.05）。然而，4个亚组间临床妊娠率及早期流产率差异均无统计学意义（均P>0.05），详见表4。
五.接受IVF/ICSI-ET的RPL患者妊娠结局的回归分析将分组因素作为自变量进行妊娠结局的单因素logistic回归分析，后将表3中各基线资料纳入妊娠结局的单因素logistic回归分析，结果P<0.1时，将其作为协变量纳入妊娠结局的多因素logistic回归分析（表5）。以Q1亚组为对照，其余各亚组与其相比，临床妊娠率差异均无统计学意义（均P>0.05）。流产率的单因素回归分析结果显示，Q2亚组、Q3亚组、Q4亚组流产率均显著高于Q1亚组；而在多因素logistic回归矫正混杂因素后，仅Q3亚组、Q4亚组流产率显著高于Q1亚组，差异均具有统计学意义。活产率的多因素logistic回归显示，Q3亚组、Q4亚组患者活产率显著低于Q1亚组，差异均具有统计学意义。
讨论RPL病因复杂且严重危害育龄期女性的身心健康［16-17］。相关研究表明，有妊娠意愿的女性中发生RPL的比例可达2.5%［18］。因此，探讨RPL的潜在风险因素对于识别高危人群、制定个体化诊疗方案具有重要临床意义［19］。20世纪末，Nygård等［20］根据大量流行病学和临床研究数据就已提出HHcy是动脉粥样硬化及动脉和静脉血栓栓塞的独立危险因素。血浆Hcy水平升高与血小板活性增强和凝血呈正相关［21］，既往研究显示RPL与亲血栓基因多态性、胎盘动脉血栓形成有关［22］。既往meta分析显示，RPL患者的Hcy水平高于正常对照组，差异有统计学意义［23-24］。因而推测Hcy可能与RPL有着一定关联。
本研究对RPL患者和既往从未发生妊娠丢失患者的Hcy值进行比较，结果显示RPL患者的Hcy水平明显高于未发生妊娠丢失的患者；通过多因素logistic回归分析进一步证实高水平Hcy是患者发生RPL的独立危险因素。
本研究进一步分析了Hcy水平对RPL患者接受IVF/ICSI-ET后妊娠结局的影响。结果显示，Hcy水平较高的RPL患者（Q3亚组和Q4亚组）早期流产率、流产率显著高于Hcy水平较低的患者（Q1亚组），而活产率则显著降低（P<0.05）。既往有研究表明，Hcy水平升高与不良妊娠的发生密切相关，妊娠早期和中期Hcy水平升高可导致不良妊娠的风险增加3倍以上［25］。HHcy通过促进活性氧的产生以及损害相关的抗氧化系统诱导产生氧化应激［26］，进而使去整合素金属蛋白酶水平升高，引起内皮功能障碍，内皮细胞功能失调或受损，会合成并释放多种因子，促进血小板聚集和血栓形成［27］。HHcy对妊娠结局的影响可能通过多途径协同作用。胚胎发育层面，临床研究显示，血清中Hcy水平升高与胚胎质量下降相关［28］，相关动物实验也进一步证实了HHcy可诱导胚胎基因组DNA甲基化，从而影响胚胎发育［29］。子宫内膜容受性层面，Hcy水平升高可下调血管内皮生长因子表达，进而抑制子宫内膜血管生成，导致子宫内膜容受性受损［30］。胎盘功能层面，HHcy介导的氧化应激不仅减少绒毛血管密度，还直接诱导滋养细胞凋亡，影响母-胎界面物质交换；同时，胎盘血管内血栓形成进一步加剧灌注不足，形成“氧化损伤-血栓-缺血”恶性循环，导致胎盘功能进行性减退［31］。综上，HHcy可能影响胚胎质量、降低子宫内膜容受性、损害胎盘功能，最终导致不良妊娠结局，但其具体机制仍需进一步研究阐明。
基于本研究结果，我们建议在RPL患者的临床管理中，应重视Hcy水平的检测和干预丰泰优配。可考虑健康生活方式干预，包括戒烟、限酒、合理膳食、增加运动量等［32］。同时也可补充叶酸、维生素B12、维生素B6、胆碱与甜菜碱以可能促进Hcy代谢，降低Hcy水平［33］。
本研究尚存在以下不足之处：①本研究纳入的样本量相对有限，还需更大样本量研究来进一步验证；②本研究数据来源于单中心医疗机构，可能会产生选择偏倚，并且记录时可能发生的遗漏或错误会直接影响到最终结果的准确性及可靠度；③尽管本回顾性研究选取移植前约1周患者行Hcy检测的结果，且进行了多因素logistic回归以校正混杂因素，由于本研究为回顾性研究，受限于现有记录的完整性，我们无法完全获得所有患者的叶酸或维生素B12补充剂量及持续时间。此外，关于生活方式因素，部分患者的吸烟、饮酒史记录不全，且难以量化其影响，因此存在不明混杂因素影响研究结果的可能，我们需要谨慎对待本研究的结果。未来，可进一步开展多中心前瞻性研究，收集患者用药数据，动态监测Hcy变化水平。
综上所述，本研究表明，Hcy水平异常升高是IVF/ICSI患者RPL的高危因素，并会对RPL患者IVF/ICSI-ET妊娠结局产生不利影响。临床实践中，应重视Hcy水平的检测和干预，以改善RPL患者的预后。
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